正就读中学的少年迈尔斯【沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音】意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化像优美的音乐缓缓流淌，多么美丽的夜晚。然而，伴随着无尽的黑夜，只有人类无尽的忏悔和自责被独自锁在被改造成房子的地方偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠【克里斯·派恩 Chris Pine 配音】和犯罪头目金并【列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音】的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克【杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音】出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。 他们合力与恶势力展开斗争……